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货号:Cat. No. T91202-5   Size: 5次(试用装)
货号:Cat. No. T91202-50     Size: 50次
—— 产品介绍
     本产品是经过精心优化的、基于MMLV逆转录酶和Taq DNA聚合酶的双酶一管式RT-PCR试剂盒,它含有除模版RNA和其专一性引物以外的所有RT-PCR试剂,包括MMLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、RT-PCR缓冲液等,可以在同一反应管内完成 RNA→cDNA→PCR反应 (RT-PCR 反应)。
—— 产品特色
1、一管式完成RT-PCR反应,避免样品交叉污染,尤其适合临床应用。
2、即开即用,用户不需要单独准备RT-PCR所需的各种试剂。
3、主要成分只有两个RT-PCR buffer和MMLV-Taq Mix,将加样步骤减少到最低,极大降低了加样误差,增加了可重复性。
4、使用范围广,适用于从病毒RNA到人RNA的各种RNA模板。
5、高灵敏度,每个RT-PCR体系最低可以检测200拷贝的RNA分子,可扩增的模版RNA的最长达2000 nt。
6、所得RT-PCR产物可以直接用于AT克隆。
—— 操作步骤
注意:所有离心管用前最好全部短暂离心几秒使管壁上溶液沉淀到管底。下面以一个30μL体系的RT-PCR为例,如果体积不同,各成分用量需要适当调节。
1.  在一干净的无RNase的PCR管中,先加入下列成分:
成分
阴性对照
样品
RNA模板(自备,分下面三种情况)
见下
总RNA
100-500ng
或poly(A) mRNA
10-500 ng
或体外转录得到的专一RNA
0.01 pg-500ng
RNA特异性引物一(自备)
终浓度300nM
终浓度300nM
RNA特异性引物二(自备)
终浓度300nM
终浓度300nM
探针(仅对Realtime RT-PCR)
终浓度200nM
终浓度200nM
RNase-free水
补到13 uL
补到13 uL
双酶一管式RT-PCR Buffer(2×)
15 uL
15 uL
MMLV-Taq Mix
2 uL
2 uL
注:通常初次使用本试剂时,可用引物浓度300nM,探针浓度200nM进行实验,根据实验结果具体情况,在200~800nM范围
   内调整引物浓度,在50~400nM范围内调整探针浓度以达到最佳检测效果。引物、探针、待检样品的具体加量用户可
   以根据实际情况调整,同时增减DEPC水用量,保证总反应体积不变即可。
2.  轻柔混合均匀后放入PCR仪中进行RT-PCR。
3.  设定RT-PCR反应条件时,一般将RT的条件设定成42℃30分钟,后接94℃变性5分钟,然后进入PCR循环(PCR参数将根据自备引物的Tm值由用户自行决定注)、最后72℃5分钟。对Realtime PCR,在复性步骤设置荧光检测,检测通道:FAM/HEX/VIC/ROX/CY5
4.   RT-PCR结束后取5-10 μL电泳检查。
——— 保存条件
     低温运输,-20℃保存,有效期1年。
—— 注意事项
1.  使用已校准的移液器,选用一次性PCR反应管、离心管、tip头等进行样本处理及配液等操作,所有用具应不含DNA酶和RNA酶。
2.  引物、探针设计过程中应尽可能避免发夹结构、二聚体等现象的发生,探针的位置尽可能靠近上游引物, PCR目标片段最好小于200bp,尽可能在150bp以内。
3.  实验样品尽可能新鲜,提取过程应严防RNA酶污染及操作不当导致的RNA降解。
4.  使用本产品时建议对RT-PCR扩增条件、引物浓度和样品用量进行调整,选择最适当的引物浓度、样品浓度和PCR扩增条件。
5.  本产品使用前应在室温充分融解,并用漩涡震荡器充分混匀。
6.  统一配液后分装以减少加样误差,每次实验应设置阴性对照。
7.  禁止标记PCR反应管,避免外源性荧光信号干扰。
8.   PCR反应管中不能有气泡,否则会产生非特异的荧光信号。若有气泡,可先用手指将气泡弹破,然后再低速离心消除。
9.  实时荧光PCR仪器连续进行实验时,最好间隔1小时以上再使用。
10.  实时荧光PCR仪需经常校正和清洁载样板板孔。
11.  若使用Roch LightCyclerTM荧光PCR仪,应将毛细管放在专门套管中,以便分装反应体系和加入待检样品。前述操作完毕应低速离心数秒再将毛细管垂直缓慢放入样品架,以免折断;若发生折断,应小心取出,用专用小毛刷擦拭干净后方可进行扩增。
12.  实验室应严格分区,避免PCR产物污染。